Es ist schwierig, eine Straße ohne Straße zu schaffen: die legendäre Entdeckungsreise des grün fluoreszierenden Proteins

Grün fluoreszierendes Protein kann durch Selbstkatalyse Chromophore bilden und unter Stimulation durch blaues oder ultraviolettes Licht grüne Fluoreszenz emittieren. Durch Gentechnik und Fusion mit anderen Proteinen können unsichtbare Proteine ​​sichtbar gemacht werden. Daher ist es in den letzten zwei Jahrzehnten für Biologen und Mediziner zu einem Leitfaden für die Untersuchung verschiedener biochemischer Prozesse in Zellen geworden. Man kann sagen, dass es ein wichtiges Werkzeug für die biologische Forschung ist. Für seine ursprüngliche Entdeckung und die darauffolgende wichtige Entwicklung erhielt es 2008 den Nobelpreis für Chemie und die Entdeckungsreise der Wissenschaftler, die sich ihm widmeten, kann als legendäre Geschichte in der Geschichte der Wissenschaft bezeichnet werden.

Geschrieben von | Xu Yixun

Die Entwicklung der Biowissenschaften verläuft von der makroskopischen Ebene, die leicht zu beobachten ist (wie etwa die Klassifizierung von Arten und die makroskopische Anatomie), bis hin zur mikroskopischen Ebene, für deren Beobachtung Instrumente erforderlich sind (wie etwa die Untersuchung von Geweben und Zellen in der mikroskopischen Anatomie). Im 17. Jahrhundert nutzte der niederländische Wissenschaftler Antonie van Leeuwenhoek sein verbessertes optisches Mikroskop, um erstmals einzellige Organismen zu beobachten und zu beschreiben, was einen Wendepunkt in der Geschichte der Biologie darstellte. Mithilfe von Mikroskopen konnten Biologen nach und nach mikroskopische Forschungsobjekte wie Bakterien, Zellen und Organellen beobachten, deren Existenz bislang unbekannt war. Wenn diese reduktionistische Forschung erst einmal die molekulare Ebene erreicht, wird es selbst mit Elektronenmikroskopen schwierig für uns, die Expression und Lokalisierung biologischer Makromoleküle wie Proteine ​​in lebenden Zellen direkt zu beobachten. Das aus der Victoriaqualle (Aequorea victoria, im Folgenden Qualle oder Qualle genannt) isolierte grün fluoreszierende Protein (GFP) hat das einst unsichtbare Protein sichtbar gemacht. In den letzten zwei Jahrzehnten ist es für Biologen und Mediziner zu einem Leitstern bei der Untersuchung verschiedener biochemischer Prozesse in Zellen geworden. Dieser Artikel erzählt die Geschichten mehrerer Wissenschaftler, die wichtige Beiträge zur biologischen Revolution geleistet haben, die durch GFP ausgelöst wurde.

Frühe Studien zur Biolumineszenz

Die Entdeckung von GFP ist eng mit dem Phänomen der Biolumineszenz verbunden, daher müssen wir zunächst die verschiedenen Arten der Niedertemperaturlumineszenz vorstellen.

Abbildung 1: Verschiedene Arten von Tieftemperatur-Lumineszenzphänomenen und ihre Anregungsmodi

Feuer ist die wichtigste Erfindung der Menschheitsgeschichte und die damit verbundene Glühglut wird üblicherweise als das sichtbare Licht definiert, das ausgestrahlt wird, wenn ein Objekt auf eine hohe Temperatur erhitzt wird. Niedertemperaturlumineszenz ist eine Art sichtbaren Lichts, das spontan von angeregten chemischen Komponenten emittiert wird, die sich nicht im thermischen Gleichgewicht mit der Umgebung befinden. Vor mehr als 2.500 Jahren schrieb der antike griechische Wissenschaftler Aristoteles in seinem Buch „Über Farben“: „Einige Objekte, die kein Feuer sind und nichts mit der Entstehung von Feuer zu tun haben, scheinen auf natürliche Weise zu leuchten.“ Dies bedeutet, dass die Menschen sich des wichtigen Unterschieds zwischen Glühlampen- und Niedertemperatur-Leuchtstoffröhren schon lange bewusst sind: Glühlampen sind bei der Beleuchtung nicht sehr effizient und können nur einen kleinen Teil der elektrischen Energie in Lichtenergie umwandeln, während die restliche Energie in Form von Wärme verloren geht. Biolumineszenz hingegen ist eine effiziente chemische Reaktion, bei der bei der Umwandlung chemischer Energie in Lichtenergie nahezu keine Wärme entsteht, weshalb sie auch als „kaltes Licht“ bezeichnet wird.

Je nach Anregungsmodus kann die Niedertemperaturlumineszenz in viele Typen unterteilt werden, beispielsweise Photolumineszenz, Elektrolumineszenz, Chemilumineszenz (Biolumineszenz ist eine spezielle Art der Chemilumineszenz) usw. (Abbildung 1). Die häufigsten Photolumineszenzarten sind Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Den Lesern wird empfohlen, besonders auf den Unterschied zwischen Fluoreszenz und Biolumineszenz zu achten.

Eines der häufigsten biolumineszenten Phänomene in der Natur sind Glühwürmchen. Jede Sommernacht tanzen Glühwürmchen im Gras und schaffen eine zauberhafte und wunderschöne Szene. Li Bai, ein großer Dichter der Tang-Dynastie, schrieb einst ein Gedicht mit dem Titel „Ode an die Glühwürmchen“: „Glühwürmchen können nur schwer gelöscht werden, wenn sie vom Regen getroffen werden, und werden heller, wenn sie vom Wind verweht werden. Wenn sie in den Himmel fliegen könnten, würden sie sicherlich zu Sternen neben dem Mond werden.“

Abbildung 2: Die Erforschung der Biolumineszenz begann mit der Faszination der Wissenschaftler für das Phänomen der Glühwürmchen.

Neben Glühwürmchen gibt es in der Natur zahlreiche Arten, die bei niedrigen Temperaturen leuchten können, darunter Bakterien, Protozoen, Pilze, Quallen, Tintenfische usw. Das Phänomen der Biolumineszenz hat die Wissenschaft schon lange beschäftigt, es fehlte ihnen jedoch an wirksamen wissenschaftlichen Forschungsmethoden. Erst im Jahr 1667 pumpte der britische Chemiker Robert Boyle mit einer Luftpumpe die Luft aus der Glasglocke und entdeckte, dass die Pilze im Inneren nicht mehr leuchteten. Als er wieder Luft hinzufügte, kehrte die Fähigkeit des Pilzes zur Biolumineszenz zurück. In der chemischen Welt des 17. Jahrhunderts wussten die Menschen nichts über die Zusammensetzung der Luft. Erst in den 1770er Jahren, mit der unabhängigen Entdeckung des Sauerstoffs durch den schwedischen Chemiker Carl Wilhelm Scheele und den britischen Chemiker Joseph Priestley und deren abschließende Aufklärung durch den französischen Chemiker Antoine Lavoisier, wurde die Abhängigkeit der Biolumineszenz von Sauerstoff endgültig klar.

Nach mehr als einem Jahrhundert der Stagnation erreichte die Erforschung des chemischen Mechanismus der Biolumineszenz mit der Ankunft des französischen Physiologieprofessors Raphael Dubois einen neuen Wendepunkt. In einem Experiment im Jahr 1885 homogenisierte Dubois zunächst das leuchtende Gewebe des Schnellkäfers (Pyrophorus) in einem Reagenzglas mit kaltem Wasser und stellte fest, dass der Extrakt kurz aufleuchtete und dann schwächer wurde. Die Gewebeextrakte, die er mit kochendem Wasser gewann, leuchteten überhaupt nicht. Zu seiner Überraschung begann die Mischung tatsächlich wieder zu glühen, als der abgekühlte Heißwasserextrakt zu dem Kaltwasserextrakt gegeben wurde, der aufgehört hatte zu glühen (Abbildung 3). Wenn Dubois wollte, dass der Kaltwasserextrakt weiter leuchtet, müsste er ständig gekühlten Heißwasserextrakt hinzufügen.

Abbildung 3: Dubois‘ berühmtes Experiment aus dem Jahr 1885, bei dem er erstmals das Prinzip der Biolumineszenz von „Luciferin-Luciferase“ entdeckte [Pieribone, V. & Gruber, DF (2005) Aglow in the Dark: The Revolutionary Science of Biofluorescence, Belknap Harvard.]

DuBois erzielte später ähnliche experimentelle Ergebnisse bei anderen leuchtenden Organismen, einschließlich Glühwürmchen, und kam zu zwei wichtigen Schlussfolgerungen: (1) Die Biolumineszenzreaktion erfordert neben Sauerstoff mindestens zwei chemische Komponenten; und (2) Die „Brennstoff“-Komponente in der Lumineszenzreaktion kann der hohen Temperatur von kochendem Wasser standhalten, während der „Zünder“ oder Katalysator nicht hitzebeständig ist. DuBois entschloss sich, für die Benennung der beiden Komponenten das lateinische Wort Lucifer (wörtlich „Lichtbote“) aus der römischen Mythologie zu verwenden: Der hitzelabile Katalysator erhielt den Namen Luciferase, das hitzebeständige kleine Molekül den Namen Luciferin (französisch: luciferine, englisch: luciferin).

Nachfolgende Studien vieler Biologen haben gezeigt, dass Luciferasen bei vielen leuchtenden Spezies unterschiedliche Proteinsequenzen aufweisen und Luciferine ebenfalls unterschiedliche organische Kleinmolekülstrukturen präsentieren, das Biolumineszenzprinzip „Luciferin-Luciferase“ jedoch gültig ist. Das Ziel der Biolumineszenzforscher kann dann konkretisiert werden: Auswahl einer interessanten lumineszierenden Spezies und Verwendung biochemischer Methoden zur Trennung und Reinigung verschiedener Luciferine und Luciferasen. Durch eingehende Forschungen am Lumineszenzsystem des Glühwürmchens entdeckten Wissenschaftler bald, dass neben Sauerstoff, Luciferin und Luciferase auch ATP und Mg2+-Ionen notwendige Voraussetzungen sind (Abbildung 3).

Biolumineszenz ist bei terrestrischen Arten ungewöhnlich, in der Tiefsee können jedoch mehr als 90 % der Meeresorganismen Biolumineszenz betreiben. Die Intensität des Sonnenlichts nimmt pro 75 Metern Abstieg vom Meeresspiegel um das Zehnfache ab. In Tiefen außerhalb der Reichweite des Sonnenlichts haben biolumineszierende Tiere deutliche Vorteile bei der Nahrungssuche, der Flucht vor Raubtieren und der Anlockung von Partnern. Nachdem der Lumineszenzmechanismus von Glühwürmchen grob erklärt worden war, richteten viele Wissenschaftler ihre Aufmerksamkeit auf leuchtende Meeresorganismen. Der berühmteste von ihnen war Professor Harvey (E. Newton Harvey), der Gründer der Schule an der Princeton University in den Vereinigten Staaten.

Im Jahr 1916 reiste der damals 28-jährige Harvey mit seiner Frau zur Hochzeitsreise nach Japan. Die Gewässer in der Nähe der Misaki Seaside Experiment Station eignen sich für die beiden zum nächtlichen Schwimmen. Beim Schwimmen war Harvey fasziniert von einem leuchtenden Meereslebewesen namens Vargula hilgendorfii (früher bekannt als Cypridina). Meeresglühwürmchen sind nach dem Sammeln und Trocknen lange haltbar und können durch Befeuchten mit Wasser wieder zum Leuchten kommen. Daher werden sie von Harvey als das beste experimentelle Material für die Untersuchung der Biolumineszenz mit biochemischen Methoden angesehen. Harveys Labor fand heraus, dass das Lumineszenzsystem von Glühwürmchen einfacher ist als das von Leuchtkäfern. Es benötigt lediglich Luciferin, Luciferase und Sauerstoff, jedoch kein ATP und keine Mg2+-Ionen (Abbildung 4). Nachdem Harveys Team das Luciferin aus dem Seeglühwürmchen teilweise gereinigt hatte, gelang es ihnen trotz über 20-jähriger harter Arbeit nicht, die Kristalle zu gewinnen. Ohne hochreines Luciferin wäre es ihnen nicht möglich, den chemischen Mechanismus der Lumineszenz von Seeglühwürmchen durch Bestimmung ihrer Molekularstruktur eingehend zu erforschen.

Abbildung 4: Luciferin-Luciferase-Biolumineszenzsystem des See-Glühwürmchens

Osamu Shimomura kristallisiert und reinigt Luciferin aus Glühwürmchen

Die Schwierigkeit, das Luciferin der Glühwürmchen vollständig zu reinigen, bot Osamu Shimomura, dem ersten Protagonisten der GFP-Geschichte, die Gelegenheit, die historische Bühne zu betreten. Im Vergleich zu James Watson, der ebenfalls 1928 geboren wurde, ist Shimomura Osamus „Lebensanfang“ lediglich eine „negative Kontrolle“ des letzteren, voller Höhen und Tiefen. Da sein Vater Soldat war, wuchs Shimomura Osamu hauptsächlich bei seiner Großmutter auf, die in der Stadt Isahaya in der Präfektur Nagasaki lebte. Im April 1941 mussten Shimomura Osamu, der gerade in die erste Klasse der Isahaya Junior High School gekommen war, und seine Klassenkameraden gemäß dem im März desselben Jahres von der japanischen Regierung überarbeiteten Nationalen Allgemeinen Mobilmachungsgesetz an einer militärischen Ausbildung teilnehmen. Als im Herbst 1944 das dritte Jahr der Mittelschule begann, fiel der Unterricht regelmäßig aus und die Schüler mussten freiwillig in einer Militärflugzeug-Reparaturfabrik in der Stadt Omura arbeiten. Das US-Militär nahm diese Militärfabrik bald ins Visier und entsandte mehr als 20 B-29-Bomber, um sie vollständig zu zerstören. Mehrere Klassenkameraden von Shimomura Osamu, die nicht schnell genug rannten, kamen leider ums Leben.

Wie das Sprichwort sagt: „Glück kommt nie allein, und Unglück kommt nie allein.“ Am 9. August 1945 um 10:57 Uhr wurde die Stadt Nagasaki unglücklicherweise von der zweiten Atombombe des US-Militärs getroffen. Zu dieser Zeit arbeiteten Osamu Shimomura und mehrere seiner Klassenkameraden in einer anderen Militärfabrik, 15 Kilometer vom Zentrum Nagasakis entfernt. Als der bekannte Fliegeralarm ertönte, verließen sie seelenruhig die Fabrik und stiegen auf einen nahegelegenen Hügel, um abzuwarten. Shimomura Osamu sah einen B-29-Bomber, der nach Süden in Richtung Stadtzentrum flog und drei Lastenfallschirme abwarf. Später stellte sich heraus, dass es sich dabei um drei Höhenwetterlote handelte, die von der Maschine „Great Artist“ zwischen dem Abwurf der Atombombe und der endgültigen Explosion abgeworfen wurden, die sie nicht gesehen hatten. Zu diesem Zeitpunkt glaubten alle fälschlicherweise, dass die Bombardierung keine große Bedrohung darstelle, und beschlossen daher, in die Fabrik zurückzukehren und zu versuchen, weiterzuarbeiten. Sobald sie sich hingesetzt hatten, blendete ein starker Lichtblitz vor dem Fenster die Schüler für eine halbe Minute, gefolgt von einem lauten Knall und einer plötzlichen Änderung des Luftdrucks … Die Entfernung zwischen der Militärfabrik und Nagasaki war offensichtlich der Schlüssel zum Überleben von Shimomura Osamu und seinen Freunden.

Obwohl der Zweite Weltkrieg mit der Kapitulation Japans endete, sah der 17-jährige Shimomura Osamu immer noch keine Hoffnung für die Zukunft. Viele Lehrer und Schüler der Jianhai Junior High School kamen bei der Atombombenexplosion ums Leben und alle Schülerakten wurden vernichtet, sodass die Schüler der Junior High School in den letzten Jahren keinen normalen Abschluss machen konnten. Shimomura Osamu bewarb sich zwei Jahre in Folge um die Zulassung zur High School (japanisch: Gaode Gakkou) bzw. technischen Hochschule (japanisch: Gaode Gongye Gakkou), scheiterte jedoch, weil er sein Zeugnis der Mittelschule nicht vorlegen konnte. Erst im April 1948 wurde Shimomura Osamu an der Pharmazieschule aufgenommen, obwohl er kein Interesse daran hatte, da die Lehrer- und Studentenschaft des Nagasaki Medical College nach der schweren Atombombenexplosion dringend wiederhergestellt werden musste (Abbildung 5). Dies war zu dieser Zeit seine einzige Möglichkeit, eine höhere Bildung zu erlangen.

Abbildung 5: Temporärer Campus des Nagasaki Pharmaceutical College im Jahr 1948

Dem Nagasaki Medical College, das gerade auf den Ruinen wiederaufgebaut worden war, fehlten die Lehrressourcen enorm. Bei der Atombombenexplosion kamen zwölf der ursprünglich zwanzig Professoren ums Leben, vier wurden schwer verletzt. Die Lehraufgaben im Pharmaziestudium können größtenteils nur von unerfahrenen Dozenten übernommen werden. Aufgrund begrenzter Lehrmittel konzentrierte sich Shimomura Osamu während seines dreijährigen Grundstudiums auf analytische Chemie und physikalische Chemie und hatte nur wenige Gelegenheiten, organische Chemie zu erlernen oder Experimente zur organischen Synthese durchzuführen. Shungo Yasunaga, Osamu Shimomuras Lehrer für analytische Chemie, entdeckte bald die herausragenden praktischen Fähigkeiten seines Schülers und erlaubte ihm, einige Reagenzien mit nach Hause zu nehmen, um die Trennung und Reinigung mittels Kapillarchromatographie zu studieren. Diese Forschung führte schließlich dazu, dass Shimomura Osamu 1953 gemeinsam mit Professor Yasunaga seine erste wissenschaftliche Arbeit auf Japanisch veröffentlichte.

Im März 1951 schloss Shimomura Osamu sein Studium am Nagasaki Pharmaceutical College als bester seines Jahrgangs ab und bewarb sich um eine Stelle bei der Takeda Pharmaceutical Company. Ein Interviewer wies ihn jedoch offen darauf hin, dass seine Persönlichkeit für eine Entwicklung in einem Konzernumfeld nicht geeignet sei. Professor Yasunaga bot Shimomura Osamu rechtzeitig seine Hilfe an und lud ihn ein, als Assistenzlehrer für analytische Chemie an der Schule zu bleiben. Osamu Shimomura hatte keine konkreten Pläne für sein zukünftiges Leben. Er konzentrierte sich einfach auf seine Arbeit und dachte nie daran, sich an einer Graduiertenschule zu bewerben, um einen höheren Abschluss zu erlangen. Nachdem er vier Jahre für Shimomura Osamu gearbeitet hatte, sicherte ihm Professor Yasunaga eine einjährige bezahlte akademische Gastprofessur an anderen Institutionen.

Als erster Wohltäter in Shimomura Osamus Karriere ergriff Professor Yasunaga auch die Initiative, ihm bei der Suche nach einem geeigneten Gastlabor zu helfen. Ernsts Kontakte zur japanischen Chemie-Community bestehen hauptsächlich an der Universität Nagoya. Er glaubt, dass Professor Fujio Egami, der auf Biochemie spezialisiert ist, die beste Person ist, um Shimomuras wissenschaftlichen Forschungshorizont zu erweitern. Das japanische Telefonkommunikationssystem wurde nach dem Krieg viele Jahre lang nicht vollständig wiederhergestellt. Professor Yasunaga musste Shimomura Osamu persönlich abholen und mehr als zehn Stunden mit dem Zug von Nagasaki nach Nagoya fahren. Unerwarteterweise war Professor Egami in diesen Tagen auf einer akademischen Konferenz und sie konnten ihn nicht treffen. Es gibt zahllose Beispiele dafür, dass zufällige Ereignisse den Verlauf der historischen Entwicklung verändert haben. Wenn Shimomura Osamu Professor Egami getroffen und sein Labor erfolgreich betreten hätte, würden die Leser diese interessante Geschichte jetzt wahrscheinlich nicht lesen. Anschließend besuchten die beiden Männer den organischen Chemiker Professor Yoshimasa Hirata, und nach einem kurzen Gespräch von wenigen Minuten hieß Professor Hirata Shimomura jederzeit willkommen, als Gaststudent in sein Labor zu kommen.

Im April 1955 zeigte Professor Hirata auf einen Vakuumexsikkator und sagte zu Osamu Shimomura, der sich gerade im Labor gemeldet hatte: „Hier befinden sich viele getrocknete Meeresglühwürmchen. Dieses Meerestier leuchtet durch die Wechselwirkung von Luciferin und Luciferase. Das Luciferin der Meeresglühwürmchen ist sehr instabil und zersetzt sich bei Kontakt mit Sauerstoff. Sind Sie bereit, dieses Luciferin zu reinigen und zu kristallisieren?“ Shimomura Osamu wusste, dass dieses schwierige Thema für die Doktoranden von Professor Hirata nicht geeignet war. Als Gaststudent hatte er nicht die Last eines Studienabschlusses zu tragen und war entschlossen, es mit der entspannten Haltung eines „neugeborenen Kalbs“ mutig zu versuchen. Bereits 1935 erfand Rubert Anderson aus Harveys Labor eine zweistufige Extraktionsmethode, mit der dieser sehr instabile Luciferin-Teil etwa 2.000-mal gereinigt und durch Absorptionsspektroskopie auf die Aminosäurekomponenten in seiner Molekülstruktur geschlossen werden konnte. Auf dieser Grundlage berechnete Shimomura Osamu, dass zur Gewinnung von Luciferin in kristalliner Reinheit mindestens 500 Gramm getrocknete Meeresglühwürmchen als Ausgangsmaterial erforderlich wären, also das Zehnfache der in Harveys Labor verwendeten Menge. Daher musste er einen riesigen Soxhlet-Extraktor bauen (Abbildung 6, links).

Abbildung 6: Nach zehn Monaten harter Arbeit schloss Shimomura Osamu 1956 die Reinigung und Kristallisation von Luciferin aus dem Seeglühwürmchen ab (auf dem Schwarzweißfoto kann die tatsächliche tiefrote Farbe der Kristalle nicht gezeigt werden).

Im Laufe seiner mühsamen wissenschaftlichen Forschung entdeckte Osamu Shimomura, dass die Verwendung von Stickstoff oder Inertgas nicht ausreichte, um den Verbrauch von Luciferin durch Spuren von Sauerstoff im Extraktionssystem zu verhindern. Er musste Wasserstoff in das System einleiten, damit Spuren von Sauerstoff in flüssiges Wasser umgewandelt und von der Schwefelsäure absorbiert würden. Alle Chemiker wissen, dass unsachgemäßer Umgang mit Wasserstoff zu Explosionen führen kann. Daher hielten die anderen Mitglieder von Hiratas Labor einen beträchtlichen Abstand zu Shimomura Osamu, wenn dieser intensive Experimente durchführte. Obwohl die Verwendung von Wasserstoff für Shimomura Osamu einen Durchbruch darstellte, scheiterten Versuche, ihn mit verschiedenen Methoden zu kristallisieren, stets. Jeder Versuch, den Extrakt vor der Kristallisation vorzubereiten, erforderte von ihm eine Woche ununterbrochene Arbeit mit sehr wenig Schlaf. Nach einem Fehlschlag konnte der Extrakt nur einer einfachen Komponentenanalyse unterzogen werden, bevor er verschrottet wurde. Im Durchschnitt schuftete Shimomura Osamu, der nie aufgab, auf diese Weise eine Woche im Monat, bis es eines Nachts im Februar 1956 so aussah, als würde er erneut scheitern. Bevor er nach Hause ging, beschloss er, dem Extrakt, der entsorgt werden sollte, die gleiche Menge konzentrierter Salzsäure hinzuzufügen. Nachdem die gelbe Lösung dunkelrot geworden war, ließ er sie über Nacht auf dem Labortisch stehen, um am nächsten Tag zu versuchen, herauszufinden, welche Aminosäuren sie enthielt.

Als Shimomura Osamu am Morgen ins Labor zurückkehrte, stellte er fest, dass sich die Farbe der Lösung von dunkelrot zu farblos verändert hatte. Sein erster Gedanke war, dass es sich um die Folge der Salzsäure handelte, die die Hydrolyse von Luciferin verursachte. Dann fand er am Boden des Reagenzglases eine kleine Menge schwarzen Niederschlags und bei näherer Betrachtung durch ein Mikroskop stellte er fest, dass es sich tatsächlich um rote, nadelförmige Kristalle handelte (Abbildung 6, rechts)! Diese Kristalle konnten leuchten, wenn sie mit Luciferase-Extrakt aus Meeresglühwürmchen vermischt wurden, womit die Luciferin-Kristallisation offiziell als Erfolg erklärt wurde. Rückblickend kann die Tatsache, dass konzentrierte Salzsäure die Kristallisation von Luciferin förderte, obwohl dessen Struktur unbekannt war, nur eine zufällige Entdeckung sein. Darüber hinaus wurde der Kristallisationsprozess auch dadurch unterstützt, dass der Gasofen in Hiratas Labor in dieser Nacht abgeschaltet wurde und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur weiter abfiel.

„Der Himmel wird diejenigen belohnen, die hart arbeiten.“ Nach zehn Monaten harter wissenschaftlicher Forschung gelang Shimomura Osamu ein unerwarteter Durchbruch. Sein akademischer Aufenthalt an der Universität Nagoya wurde von Professor Hirata um ein Jahr verlängert, um sicherzustellen, dass seine erste englischsprachige wissenschaftliche Arbeit 1957 erfolgreich veröffentlicht wurde. Professor Harveys Nachfolger, Frank Johnson, war inzwischen ordentlicher Professor an der Princeton University in den Vereinigten Staaten. Nach der Lektüre dieses Artikels konnte er nicht anders, als sich darüber zu wundern, dass ein junger japanischer Gelehrter, der lediglich einen Bachelor-Abschluss hatte, ein schwieriges Problem lösen konnte, mit dem sich die Harvey School seit mehr als 20 Jahren herumgeschlagen hatte! Dieser seltene Erfolg eröffnete Shimomura Osamu eine wichtige Chance in seiner Karriere: Im Frühjahr 1959, kurz nach seiner Rückkehr an das Nagasaki College of Pharmacy, erhielt er ein Einladungsschreiben von Professor Johnson, in dem dieser ihn einlud, im Herbst des folgenden Jahres für drei Jahre als Gastwissenschaftler an der Princeton University zu arbeiten.

Osamu Shimomuras untrennbare Verbindung mit biolumineszierenden Quallen und Friday Harbor

Osamu Shimomura kam im September 1960 an die Princeton University. Professor Johnson teilte ihm mit, dass das Labor derzeit am meisten an der Erforschung der leuchtenden Quallen interessiert sei, und hoffte, dass er die Dynamik seines Erfolgs bei der Erforschung der Lumineszenz von Meeresglühwürmchen nutzen würde, um einen Durchbruch bei der Erforschung des Mechanismus der Quallenlumineszenz zu erzielen (Abbildung 7). Um genügend Versuchsmaterial zu erhalten, gab es in den USA damals nur die Gewässer von Friday Harbor auf den San Juan Islands im Bundesstaat Washington, wo jeden Sommer eine große Anzahl Quallen gefangen werden konnten.

Abbildung 7. Angepasst von: Chalfie, M. (2008) Nobel-Vorlesung.

Seit 1961 bringen Johnson und wichtige Mitglieder seines Forschungsteams fast jeden Sommer ihre eigene Ausrüstung mit und fahren sieben Tage lang von Princeton nach Friday Harbor, um Quallen zu sammeln. Um die Lumineszenz von Quallen mit biochemischen Methoden zu untersuchen, mussten sie zunächst eine große Anzahl geborgener Quallenschirmmembranen manuell zerschneiden (Abbildung 8) und die Laborbedingungen der örtlichen Zweigstelle der Washington University nutzen, um die herausgepresste Flüssigkeit (Quetsse) der Leuchtorgane am Rand der Schirmmembran einzufrieren und zu konservieren.

Abbildung 8: Aequorea victoria, gefunden an der Westküste Nordamerikas, und die biolumineszierenden Organe am Rand ihres Schirms. Quelle: https://www.nobelprize.org/uploads/2018/06/popular-chemistryprize2008.pdf

Die erste Forschungswoche für Osamu Shimomura und Johnson auf der Insel verlief nicht reibungslos. Sie folgten Dubois‘ „Luciferin-Luciferase“-Idee und waren immer noch nicht in der Lage, die beiden Komponenten, die hitzebeständig und hitzeunverträglich waren, zu trennen. Zu diesem Zeitpunkt hatte der junge Osamu Shimomura das Gefühl, dass er sich nicht an Dubois‘ Theorie halten müsse und die leuchtende Substanz der Qualle ohne weitere Annahmen trennen könne. Johnson war jedoch nicht bereit, Dubois‘ Theorie aufzugeben und seine Denkweise zu ändern, da diese im Laufe der Jahre ausnahmslos bei zahlreichen leuchtenden Spezies wiederholt bestätigt worden war. Da Lehrer und Schüler auf ihrer eigenen Meinung beharrten und sich weigerten, Kompromisse einzugehen, konnten sie nur an entgegengesetzten Enden eines Labortisches sitzen. Die Atmosphäre war ziemlich angespannt und unangenehm.

Wenn Osamu Shimomura bei seiner Forschung auf ein Problem stößt, unterbricht er seine Experimente gerne und sucht sich einen ruhigen Ort, um über neue Ideen nachzudenken. In Friday Harbor können Sie mit einem kleinen Boot diese unbewohnten, abgelegenen Gewässer erreichen. Shimomura Osamu ruderte mehrere Tage hintereinander aufs Meer hinaus und lag dann allein im Boot, mit geschlossenen Augen und nachdenklich. Mehrmals schlief er ein, während das Boot mit Wind und Wellen trieb. Als Shimomura eines Nachmittags von einem Nickerchen im Boot aufwachte, hatte er plötzlich eine Idee: Auch wenn die Biolumineszenz von Quallen nichts mit Luciferin und Luciferase zu tun hat, ist es wahrscheinlich, dass dennoch Protein erforderlich ist. Die Aktivität von Proteinen ist pH-empfindlich. Ist es möglich, die Lumineszenz von Quallen durch Regulierung des pH-Werts der Lösung reversibel zu hemmen? Shimomura Osamu war zu diesem Zeitpunkt sehr aufgeregt. Er ruderte mit vollem Einsatz zurück ins Labor und bereitete mehrere Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten vor. Bei pH-Werten von 7, 6 und 5 konnte der Quallenextrakt noch schwaches Licht aussenden; aber als der pH-Wert auf 4 eingestellt wurde, verschwand das schwache Licht der Lösung, was darauf hindeutet, dass Säure leuchtende Substanzen hemmen kann! Als er den pH-Wert mit Natriumbicarbonat wieder auf einen neutralen Wert einstellte, erschien das schwache Licht erneut, was darauf hindeutete, dass die hemmende Wirkung der Säure tatsächlich reversibel war (Abbildung 9).

Abbildung 9 Quelle: Shimomura, O. (2008) Nobelvorlesung

Dieser Fortschritt begeisterte Shimomura Osamu außerordentlich, doch war er immer noch verwirrt, warum der Extrakt nur ein schwaches Licht ausstrahlte. Zu diesem Zeitpunkt bot sich Shimomura Osamus „vorbereitetem Geist“ zum zweiten Mal in seiner Karriere diese schwer fassbare Gelegenheit. In einer Mittsommernacht im Jahr 1961 war Shimomura Osamu, der bis spät in die Nacht allein gearbeitet hatte, erschöpft. Er war der Meinung, dass der Quallenextrakt, der die Säure neutralisiert hatte, wenig nützte, also schüttete er ihn in die Spüle und beendete die Behandlung. Bevor er das Licht ausschaltete und ging, blickte er unbewusst zurück und war überrascht, ein helles blaues Licht aus dem Waschbecken kommen zu sehen, in das gerade der Extrakt gegossen worden war! Der nachdenkliche Osamu Shimomura begann, die Gründe für dieses Phänomen zu analysieren. Am zweiten Tag bemerkte er, dass das Meerwasser aus einem nahegelegenen Aquarium ebenfalls in dasselbe Aquarium floss, und so vermutete er, dass irgendeine Substanz im Meerwasser das schwache Licht des Quallenextrakts in starkes Licht verwandelte. Diesem Gedankengang folgend verwendete Osamu Shimomura die „Additions- und Subtraktionsmethode“, um die Ionenkomponenten mit höheren Konzentrationen im Meerwasser einzeln zu überprüfen, und entdeckte bald, dass Calciumionen die lumineszierenden Proteine ​​in Quallenextrakten sofort stimulieren können. Nachdem er Shimomura Osamus Durchbruch bei der Entdeckung der Rolle von Calciumionen miterlebt hatte, begann Professor Johnson volles Vertrauen in seine wissenschaftlichen Forschungsfähigkeiten zu gewinnen.

Nachdem Shimomura Osamu die Rolle der Calciumionen als Lumineszenzinitiator verstanden hatte, musste er den pH-Wert nicht mehr anpassen. Stattdessen musste er dem Extrakt lediglich den bekannten Calciumionenchelator EDTA hinzufügen, um das lumineszierende Protein wirksamer und reversibel zu hemmen und sicherzustellen, dass das Zielprotein während des weiteren Trenn- und Reinigungsprozesses nicht durch Lumineszenz verloren ging. Bis Ende August 1961 hatte Johnsons Team mehr als 10.000 Quallen gesammelt, Rohextrakte mit EDTA hergestellt und diese dann mit Trockeneis eingefroren. Sie brachten sie alle zurück nach Princeton und begannen mit der systematischen Proteinreinigung (Abbildung 9). Einige Monate später reinigten sie zwei Proteine: Das Protein mit der höheren Konzentration ergab etwa 5 mg und wurde Aequorin genannt, ein lumineszierendes Protein, das durch Calciumionen aktiviert werden kann; Das andere „Nebenprodukt“ eluierte aus der Flüssigkeitschromatographiesäule, bevor Aequorin im Sonnenlicht dunkelgrün erschien und den Namen Green Protein (GP; später in GFP umbenannt) erhielt. Unerwarteterweise wurde dieses damals unbedeutende „Nebenprodukt“ schließlich zu einem Schwergewicht in der Geschichte der Biowissenschaften.

Angesichts der Veröffentlichung mehrerer Arbeiten über die Reinigung von Aequorin durch Osamu Shimomura kann man seinen dreijährigen Aufenthalt als Gastwissenschaftler in Johnsons Labor als sehr fruchtbar bezeichnen. Im Jahr 1963 kehrte Shimomura nach Japan zurück und wurde als Assistenzprofessor für Wasserwissenschaften an der Universität Nagoya eingestellt. Zwei Jahre später erkannte er jedoch, dass er lieber zum Johnson Laboratory zurückkehren wollte, um den Lumineszenzmechanismus von Quallen weiter zu untersuchen. Nach mehreren Jahren unermüdlicher Bemühungen gelang es Osamu Shimomura, den Lumineszenzmechanismus des Quallengifts unter der Regulierung durch Calciumionen gründlich aufzuklären (Abbildung 10). Apoaequorin muss unter aeroben Bedingungen kovalent an den kleinen Molekül-Cofaktor Coelenterazin binden, um ein stabiles Aequorin-Zwischenprodukt mit Biolumineszenzfähigkeit zu bilden. Und diese kovalente Bindung ist tatsächlich eine Peroxidbrücke, eine Art „intrinsischer Sauerstoff“! Diese Peroxidbindung kann durch Stimulation mit Calciumionen schnell aufgebrochen werden, wobei hellblaues Licht emittiert und Kohlendioxid gebildet wird (Abbildung 10).

Abbildung 10: Biochemischer Mechanismus der Aequorin-Lumineszenz

Noch faszinierender ist, dass Coelenterazin in seiner chemischen Struktur eine deutliche Ähnlichkeit mit dem Luciferin des Seeglühwürmchens aufweist (die berühmte Arbeit von Osamu Shimomura) und es sich tatsächlich um ein „intrinsisches Luciferin“ handelt (Abbildung 11). In diesem Moment wurde Shimomura Osamu plötzlich klar, warum er im Sommer 1961 bei seiner Quallenforschung nach der traditionellen Dubois-Theorie an einer Sackgasse gelandet war. Das war wirklich „das Ende ist zurück zum Ausgangspunkt, und das ist mir jetzt erst klar geworden.“ Wenn wir diese interessante Periode der Wissenschaftsgeschichte studieren, werden wir an das berühmte Zitat des renommierten Genetikers Theodosius Dobzhansky erinnert: „Nichts in der Biologie ergibt einen Sinn, außer im Licht der Evolution.“ Von Glühwürmchen, die zum Leuchten fünf Komponenten benötigen (Luciferin, Luciferase, Sauerstoff, ATP und Mg2+-Ionen), über Meeresglühwürmchen, die nur drei Komponenten benötigen (Luciferin, Luciferase, Sauerstoff), bis hin zum lumineszierenden Protein Aequorin, das Luciferin und Sauerstoff wie eine wiederaufladbare Batterie in seinen Molekülen verbirgt, gleicht die biologische Evolution unter natürlicher Selektion tatsächlich „acht Unsterbliche, die das Meer überqueren und jeweils ihre magischen Kräfte zeigen“!

Abbildung 11: Coelenterazin, der Cofaktor von Aequorin, ist ein „intrinsisches Luciferin“

Nachdem Osamu Shimomura den biochemischen Mechanismus der Aequorin-Lumineszenz entdeckt hatte, vergaß er das grüne Protein-Nebenprodukt GFP nicht. Allerdings ist der GFP-Gehalt in Quallen relativ gering. Seiner vorläufigen Schätzung zufolge müssten Hunderttausende Quallen geborgen werden, um genügend Rohstoffe für die Reinigung und Kristallisation von GFP zu haben. Osamu Shimomuras Hingabe zur wissenschaftlichen Forschung verlieh ihm den Geist von Yugong, der Berge versetzt. Um GFP weiter zu erforschen, zögerte er nicht, jeden Sommer eine lange Reise nach Friday Harbor zu unternehmen, Jahr für Jahr, bis er genügend Rohstoffe gesammelt hatte.

Von 1962 bis 1974 vergingen zwölf Jahre wie im Flug. Shimomura Osamu reinigte schließlich genügend GFP in Johnsons Labor und erhielt erfolgreich grüne Kristalle (Abbildung 12). Um den Lumineszenzmechanismus von GFP weiter zu untersuchen, schätzte Osamu Shimomura, dass er 100 mg reines GFP-Protein zu sich nehmen müsste. Durch den Fang von mehr als 40.000 Quallen jeden Sommer könnten jedoch nur 20 mg GFP gewonnen werden. Anschließend sammelte er fünf Jahre lang weiteres Wissen, bis er 1979 den fluoreszierenden Chromophor von GFP vorläufig identifizierte (Abbildungen 12 und 13). Im Jahr 1977 beschloss der fast 70-jährige Professor Johnson, in den Ruhestand zu gehen. Die Princeton University hatte jedoch nicht die Absicht, Shimomura Osamu zu behalten, da dieser nur begrenzt in der Lage war, selbstständig Forschungsgelder zu beschaffen. Johnson konnte die Führer der Biologie -Abteilung nur davon überzeugen, Shimomura genügend Zeit zu geben, um einen Job zu finden, und ihm ein vorübergehendes Labor ein paar Meilen vom Hauptcampus entfernt zu bieten, wo er die Forschung zum GFP -Chromophore allein mit einer ungewissen Karrierekünftige durchführen musste.

Abbildung 12: Osamu Shimomura hat über einen Zeitraum von mehr als zehn Jahren die Reinigung, Kristallisation und vorläufige Identifizierung des Chromophors des GFP -Proteins von Quallen -GFP im Johnson -Labor abgeschlossen.

Johnsons Labor hat die Sequenzierungstechnologie der Proteinfragments noch nicht gemeistert, und sie haben auch nicht aktiv Mitarbeiter in diesem Bereich gesucht. Ohne die Proteinsequenz zu kennen, war Osamu Shimomuras Schlussfolgerin des GFP -Chromophors ziemlich rau (Abbildung 13), und er konnte keine endgültige Schlussfolgerung darüber zugeben, ob das Chromophor nur von den Aminosäure -Seitenketten von GFP kam (ohne die Notwendigkeit von Cofaktoren). Der durch die Geschichte verändernde Durchbruch, den GFP in Abbildung 13 in einem intrinsischen Fluoreszenzchromophor enthielt, musste Mitte der neunziger Jahre bis mehr als ein Jahrzehnt später warten.

Abbildung 13: Das GFP -Proteinmolekül Jellyfish enthält ein intrinsisches fluoreszierendes Chromophor

1981 wurde Shimomura mit Hilfe vieler Freunde in der akademischen Gemeinschaft schließlich als leitender Forscher beim Marine Biological Laboratory (MBL) in Woods Hole, Massachusetts, vier Jahre nach dem Ruhestand von Professor Johnson eingestellt. Seitdem hat sich seine Forschung auf andere leuchtende Organismen verlagert und betrifft nicht mehr die GFP von Jellishfis. Hier verwenden wir das Wissenssystem von vielen Jahren später, um mehrere wichtige Entdeckungen von Osamu Shimomura in seiner Forschung über Quallenlumineszenz zusammenzufassen: Unter der Stimulation von Calciumionen, Aequorin in der leuchtenden Organ am Rande der Jellyfish -Regenschirme, die die Binzie -Bindungen durch die Binzie -Bindungsbindung durch die Bindung der Luciferase, die die Kokosmembran und die Kokos, die die Kokosmembran und die Kokos, die die Kokosmembran und die Kokos, und die Kokus -Membran und die Illenteration durcheinander bringen. Biolumineszenz erreichen. Die durch Aequorin erzeugte Lichtenergie wird sofort durch Biolumineszenzresonanzenergieübertragung (BRET) in die nahe gelegene GFP übertragen, wodurch letztendlich die GFP -grüne Fluoreszenz für das Blockenauge sichtbar ist (Abbildung 14).

Abbildung 14: Quallen verwenden den Bret -Mechanismus, um die blaue Biolumineszenzenergie von Aequorin auf die nahe gelegene GFP zu übertragen, die grüne Fluoreszenz auslöst. Quelle: http://www.conncoll.edu/ccacad/Zimmer/gfp-ww/shimomura.html

Molekularkloning von Aequorin durch Prisher

In den 1960er Jahren, als Osamu Shimomura und Johnson Aequorin und GFP entdeckten, steckte die Molekülbiologie noch in den Kinderschuhen. Wenn Biologen die Funktion eines bestimmten Proteins untersuchen wollten, konnten sie nur die traditionelle "Einwegroute" einnehmen: eine große Anzahl von Zielspezies-Extraktproben vorbereiten und dann biochemische Methoden verwenden, um das Protein zu reinigen. Für Organismen oder Zelllinien, die künstlich in großen Mengen kultiviert werden können, sind die für die Proteinreinigung erforderlichen Rohstoffe unerschöpflich. Meeresorganismen wie Quallen können jedoch bisher nicht künstlich kultiviert werden, und das in Experimenten verwendete reine Protein erfordert arbeitsintensive kontinuierliche Fischerei und Vorbereitung, um die Versorgung sicherzustellen. Sobald die Zielspezies aufgrund von Veränderungen in der ökologischen Umgebung nicht mehr in einem festen Wasserbereich auftritt, wird die Forschung zur Proteinfunktion zum Stillstand kommen. Glücklicherweise wurde die rekombinante DNA -Technologie in den späten 1970er Jahren mit der Entschlüsselung des genetischen Codes und der Etablierung des zentralen Dogmas der Molekularbiologie entstanden, und die umgekehrte Transkriptase aus Viren brachte die starke cDNA -molekulare Klonierungstechnologie hervor. Sobald Biologen in der Lage sind, die cDNA zu klonen, die das Zielprotein in das Plasmid von Escherichia coli codiert, können sie leicht große Mengen reines Protein erhalten, indem sie die Bakterien kultivieren. Dies wird sie nicht nur von Sorgen um grundlegende funktionale Forschung freigeben, sondern auch die Entwicklung und Anwendung effizienter gestaltet.

Professor Milton Cormier von der Universität Georgien in den USA studiert seit den 1950er Jahren Biolumineszenz und konzentrierte sich in seinen frühen Jahren auf Renilla (Seebärchen). Nach der Veröffentlichung von Shimomura und Johnsons bahnbrechender Arbeit begann Cormiers Labor, einige seiner Forschungsbemühungen auf Quallen zu wenden. Der zweite Protagonist der GFP -Geschichte, Douglas Prasher, kam 1983 in Cormiers Labor, um seine zweite Runde des Postdoktoranden -Trainings zu beginnen. In seinem früheren postdoktoranden Labor konzentrierte sich Prasher auf bakterielle Genetik und beherrschte die aufstrebende molekulare Klonierungstechnologie erfolgreich, was zu dieser Zeit nicht einfach war. 1982 förderte die Veröffentlichung des berühmten experimentellen Handbuchs "Molekularkloning: Ein Laborhandbuch" (Abbildung 15) die Popularisierung der Genklonierungstechnologie stark, aber viele technische Mittel, einschließlich der Polymerase -Kettenreaktion (PCR), wurden noch nicht erfunden.

Abbildung 15: Abdeckung der ersten Ausgabe des Molekularklonierungslaborhandbuchs im Jahr 1982

Cormier hoffte, dass der Newcomer Presher die Herausforderung annehmen würde, das Aequorin -Gen zu klonieren; Wenn er erfolgreich ist, würde die Menge an Aequorin -Protein, die das Labor in einer Nacht mit E. coli produzieren könnte, die Gesamtzahl überschreiten, die sie im gesamten Sommer von Quallen purifizieren könnten, die im Hafen am Freitag gefangen sind. Die Gesamtmenge an mRNA, die aus einer einzigen Quallen vorbereitet werden kann, ist nicht hoch, und Prasher muss zum Friday Harbor gehen, um eine große Anzahl von Quallenproben wie Osamu Shimomura zu sammeln. 1985 extrahierte Prasher nach zwei aufeinanderfolgenden Sommer der Akkumulation genügend mRNA, um eine cDNA -Bibliothek zu konstruieren. Anschließend wurden molekulare Sonden, die auf bekannten Proteinsequenzen entwickelt wurden, zum Screening der cDNA -Bibliothek verwendet, und sechs cDNA -Klone, die Aequorin codieren, wurden erfolgreich isoliert, was fünf Protein -Isoformen entsprach. Nachdem Prasher diese Gene kloniert und in E. coli exprimiert hatte, konnte er die Banden, die Aequorin auf Proteingelelektrophorese entsprechen, mehrere Wochen nicht nachweisen. Cormiers wissenschaftliche Intuition teilte ihm mit, dass der Elektrophorese -Test nicht sensibel genug sei, und bat den Techniker Richard McCann sofort, vor dem Entwurf eines Biolumineszenz -Tests für Aequorin zu helfen, was schließlich den Erfolg des Genklonens bestätigte! Durch Überexpression in Escherichia coli fiel der Preis von Aequorin, einem Calciumionenfarbstoff, signifikant und wurde schnell zu einem häufig verwendeten experimentellen Reagenz.

Mit dem Schwung, das Aequorin -Gen erfolgreich zu klonieren, absolvierte Prasher schließlich zwei lange Runden nach der Postdoktoranden und wurde als unabhängiger stellvertretender Forscher an der Woods Hole Oceanographic Institution (WHOI) in Massachusetts, USA, im Oktober 1987 eingestellt. Bevor er das Labor von Cormier offiziell verließ, verließ das Labor von Natural das Tor: GFP. Angesichts der Tatsache, dass die Häufigkeit von GFP -Protein und mRNA viel niedriger ist als die von Aequorin, muss Prasher jedes Jahr zum Friday Harbor gehen, um fast 70.000 Quallen zu sammeln, um genügend totale mRNA für die zukünftige Klonen von GFP zu sammeln.

Obwohl Prasher bei WHOI unabhängig war, konnte er aufgrund begrenzter Startfonds nicht in der Lage sein, Doktoranden, Postdoktoranden oder Techniker zu rekrutieren. Gleichzeitig war er skeptisch gegenüber der von Osamu Shimomura vorgeschlagenen Hypothese, dass das GFP -Protein einen Cofaktor für Fluoreszieren benötigt. Er stellte sich vor, dass, sobald das GFP -Gen in E. coli erhalten und exprimiert wurde. Basierend auf dieser aufregenden Idee reichte Prasher mehrere Forschungsfondsanträge ein, die meisten von ihnen wurden vom Überprüfungsausschuss abgelehnt. Nur die American Cancer Society stimmte zu, 200.000 US -Dollar an Finanzmitteln bereitzustellen.

Anfang 1989, nach fast zwei Jahren harter Arbeit, untersuchte Prasher einen cDNA -Klon aus der Jellyfish -Genbibliothek, die er PGFP1 nannte. Das Plasmid enthielt eine Sequenz, die 168 Aminosäuren codiert. Prasher wusste, dass die volle Länge des GFP -Proteins 238 Aminosäuren beträgt, und bemerkte, dass sowohl die 5 "als auch 3' -Enden dieser cDNA unvollständig waren. Diese 168-Aminosäure-Proteinsequenz war für das Ward Laboratory (William W. Ward), mit dem er zusammengearbeitet hat, von großer Hilfe. Es ermöglichte es ihnen, Shimomura Osamus 1979 am GFP-Chromophor von 1979 zu verbessern und festzustellen, dass die drei verbundenen Aminosäureseitenketten (Ser65-Tyr66-GLY67) innerhalb der GFP die molekulare Grundlage für die Erzeugung grünes Fluoreszenz waren (Abbildung 16). Wenn Prescher die GFP-Fluoreszenz als Werkzeug für die molekulare Lokalisierung verwenden wollte, musste er die cDNA in voller Länge von GFP klonen, was bedeutete, dass er zurückgehen und eine neue Jellyfish-cDNA-Bibliothek bauen musste.

Abbildung 16 Quelle: Cody, CW, Prasher, DC, et al. (1993) Biochemie 32: 1212 - 1218

Chalfie und Roger Tsien haben GFP -Kennzeichnungstechnologie erstellt

Gerade als Prasher begann, erneut Quallen zu sammeln, um eine neue cDNA -Bibliothek zu bauen, erschien der dritte Protagonist der GFP -Geschichte, Martin Chalfie, auf unerwartete Weise. Charfy widmet sich der Untersuchung der taktilen Neurobiologie von C. elegans in seinem Labor an der Columbia University. Am 25. April 1989 nahm er jeden Dienstag um 12.00 Uhr wie gewohnt an der Vorlesung der Abteilung teil. Paul Brehm von der Tufts University stellte die lumineszierenden Proteine ​​verschiedener Organismen vor. Chalfie hat sich längst von Quallen gehört, die als Kalziumfarbstoffen verwendet wurde, und ist der erste, der von Quallen -GFP gehört, die grün leuchtet. Monomer -GFP -Proteine ​​durch ultraviolettes oder blaues Licht können ohne Cofaktoren fluoreszieren. Dieses Merkmal macht Chalfie, eine Person mit Interesse, sehr aufgeregt.

Obwohl C. nematoden den natürlichen Vorteil der gesamten Körpertransparenz aufweisen, erforderten mehrere zu diesem Zeitpunkt üblicherweise verwendete Genexpressions- und Proteinexpression und Lokalisierungstechniken, und da die Färbungsreagenzien, die zum Eindringen in Nematoden erforderlich sind, nicht direkt zur direkten Beobachtung von lebenden Tieren verwendet werden konnten (links in Abbildung 17). Wenn nur 238 Aminosäuren von GFP wirklich glänzen können, können Forscher molekulare biologische Mittel verwenden, um es mit dem interessierenden Nematodengen zu verschmelzen. Durch die GFP -Fluoreszenzmarkierung am Fusionsprotein können sie direkt beobachten, welche Zellen das Gen im Mikroskop exprimiert wird. Am nächsten Tag fragte Charfi darüber, ob Wissenschaftler das Gen von Jellyfish GFP erfolgreich geklont hatten, und stellten schließlich fest, dass nur Whois Preshe ihm die Antwort geben könnte, die er wollte (Abbildung 17 Recht).

Abbildung 17: C. elegans mit einem ganzen Körper eignen sich zur Untersuchung der Zelldifferenzierung und -funktion in der Tierentwicklung. Mehrere Genexpressionslokalisierungsmethoden vor der GFP -Technologie erfordern alle eine Probenvorbereitung und können nicht verwendet werden, um lebende Nematoden direkt zu beobachten. Nachdem Chalfie über die leuchtenden Eigenschaften von GFP aus Blame's Lecture erfahren hatte, kontaktierte er Prisher über einen ganzen Tag der Telefonkonsultation. Quelle: Chalfie, M. (2008) Nobelvortrag.

Charfi und Preshe hatten ein sehr spekulatives Gespräch am Telefon. Die beiden hatten ähnliche Vorstellungen über die Anwendungsaussichten von GFP, aber ihre Zusammenarbeit musste warten, bis Preshe den vollständigen cDNA -Klon von GFP bekam. In Anbetracht der Tatsache, dass das durchschnittliche Fragment der zuvor mit bakteriellen Plasmiden konstruierten Quallengenbibliothek nicht groß genug war, beschloss Presher, Lambda Phage zu verwenden, um eine neue cDNA -Bibliothek zu konstruieren. Zwei Jahre später wurde er nachgewiesen, um einen Klon von λgfp10 zu erhalten, der eine vollständige Sequenz von 238 Aminosäuren kodiert (Abbildung 18). Leider war Prisher nicht mehr in der Stimmung, diesen schrittweisen Erfolg zu feiern: (1) Der von der American Cancer Society bereitgestellte wissenschaftliche Forschungsfonds wurde verbraucht, und seine neueste Fondsanwendung wurde wiederholt abgelehnt. . . Prisher beschloss, zuerst die cDNA -Sequenz von GFP bekannt zu geben, aber die Zeitung lief seit der Einreichung nicht gut, und es dauerte fast ein Jahr, bis es im Februar 1992 offiziell veröffentlicht wurde.

Abbildung 18 Quelle: Prasher, DC, et al. (1992) Gen 111: 229 - 233

Prisher versuchte, vor und nach der Veröffentlichung der Zeitung telefonisch telefonisch zu kontaktieren. Leider war Charfi am Labor der Universität von Utah im akademischen Urlaub, wo sich seine Frau aufgrund ihres Brautes befand. Gerade als Prisher keinen Kooperationsplan eröffnen konnte, weil er sich nicht an Charfi kontaktieren konnte, las Professor Roger Tsien, der letzte Protagonist der GFP -Story, im Mai 1992 Prishers neues Papier. Professor Qian hofft, die Wechselwirkung zwischen Proteinen durch Fluoreszenz -Resonanz -Energie -Transfer (Fret) zu studieren (FRET) seit seinen Graduiertenjahren. Seit mehreren Jahren wollte er die Gen -codierenden Fluoreszenzproteine ​​erhalten. Es ist viel einfacher, Marker -Gene in die zu untersuchenden Zellen einzuführen, als Proteine ​​zu markieren. Professor Qian, der ebenfalls interessiert ist, kann den Wert des cDNA -Klons in Purishes Händen auf einen Blick sehen. Prisher sagte Professor Qian am Telefon: Aufgrund der Schwierigkeit, Geld zu beantragen, werde er Whoi bald verlassen und zum US -Landwirtschaftsministerium gehen, um seinen Posten zu übernehmen und sich von da an von der Forschung von GFP zu verabschieden. Der Priger Heim ist bereit, das Klonen des GFP -Gens sofort zu teilen. Obwohl das Labor von Professor Qian viele Chemieexperten hat, hat niemand die Technologie der molekularen Biologie beherrscht. Er muss warten, bis Roger Heim, einen neu rekrutierten Postdoktoranden, im Oktober 1992, um die vom Priger Heim gesendeten Stichproben zu erhalten und zu verarbeiten. Die fünfmonatige Verzögerung kehrt das "Grundstück" um, bei dem Charfy die GFP fast vermisst.

Abbildung 19 Quelle: Chalfie, M. (2008) Nobelvorlesung

Charfy kehrte vor Beginn des Schule im Herbst 1992 an die Columbia University zurück. Anfang September hofft die Doktorandin des ersten Studiums Ghia Euskirchen, für seine erste Rotation in Chalfies Labor zu kommen. Chalfie hörte, dass Gia gerade ihre Masterarbeit an der School of Engineering abgeschlossen hatte und mit der Fluoreszenz verwandt war, und sie konnte nicht anders, als zu seufzen, dass Prisher drei Jahre lang keine Neuigkeiten hatte, sodass sie nur die Designideen mit GFP durch Computerliteratursuche finden konnte. Chalfie war überglücklich, als er die von Preshe zu Beginn des Jahres veröffentlichte GFP -Gensequenz sah und kontaktierte sofort die Zusammenarbeit im Neustartplan telefonisch. Nachdem das GFP-Klonieren von Presher erhalten wurde, bemerkte Chalfie, dass nur die PCR-Technologie, die während des molekularen Klonierungsprozesses eingesetzt wurden, nicht (um 1992) verwendet wurden (um 1992 haben viele amerikanische wissenschaftliche Forschungseinrichtungen, einschließlich WHOI, nicht PCR-Instrumente. Auch in der Evy-Liga-Schulen Enden der GFP-Codierungssequenz und 25 Basispaare wurden stromaufwärts des 5'-Ende-Startcodons (oben rechts von Abbildung 19, rot markiert) addiert. Chalfies molekulare Biologie-Intuition sagte ihm, dass zusätzliche Sequenzen an beiden Enden die Expression von GFP in E. coli stören könnten.

Einige Wochen später erhielt Gia viele Kolonien, die GFP -Expressionsplasmide enthielten. Sie dachte, da Charfi der Meinung war, dass das Proteinprodukt von GFP direkt fluoreszierend sein könnte, könnte sie auch die Petrischale in die vertraute Ingenieurschule bringen und ihr Glück direkt mit dem Fluoreszenzmikroskop dort versuchen. Am 13. Oktober 1992 hat Jiyas experimentelles Notizbuch (links von Abbildung 19) diesen unerwarteten "Eureka -Moment" vollständig aufgezeichnet: Mehrere E. coli -Kolonien emittieren eine schöne grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop! Chalfie war von Natur aus aufgeregt, als er es sah. Er zeigte seine Flammen mit dem von GIA für mehrere Tage aufgenommenen Mikroskopfoto (unten rechts in Abbildung 19). Die experimentellen Ergebnisse zeigen deutlich, dass GFP -Protein in Zellen anderer Spezies ohne Cofaktoren spontan die grüne Fluoreszenz emittieren oder Enzyme aus Quallen umwandeln kann.

Abbildung 20: Charfine Laboratory verwendet die rekombinante DNA -Technologie, um das GFP -Gen -Gen -Gen mit dem taktilen sensorischen Neuron -Transkriptionspromotor von C. elegans zu verbinden, und zeigt erfolgreich, dass die grüne Fluoreszenz von GFP verwendet werden kann, um einzelne Zellen spezifisch zu kennzeichnen.

Quelle: https://www.nobelprize.org/uploads/2018/06/popular-chemistryprize2008.pdf

Nach Abschluss dieses Experiments ging Gia in ein anderes Labor, um zu drehen. Chalfie bat den Techniker, ein neues Experiment auszuprobieren: Verbinden Sie zuerst das GFP -Gen mit dem spezifischen Promotor des taktilen sensorischen Neurons von C. nematode und übertragen Sie dann das neu konstruierte Plasmid in die Gonaden reifen Nematoden mit Mikroinjektion. Solange GFP erfolgreich exprimiert wird, werden die taktilen sensorischen Neuronen in der nächsten Generation von Larven, die von Hermaphroditen produziert werden, durch grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop beleuchtet (Abbildung 20). Dieses erfolgreiche Breakthrough -Experiment wurde schließlich in der Geschichte der Wissenschaft als Coverpapier zum Science Magazine aufgezeichnet (Abbildung 21).

Abbildung 21 Quelle: Chalfie, M. (2008) Nobelvorlesung

Wenn man viele Jahre später zurückblickte, hätte Gias "Eureka -Moment" Prishe gehören können, und der "Täter", der ihn vermisst hat, ist wahrscheinlich die 25 Basispaare, die zum 5 'Ende von λgfp10 hinzugefügt werden! Als Einzelzell-Prokaryoten weist E. coli eine relativ einfache Regulation der Gentranskription auf. Es benötigt nur einen Promotor und eine regulatorische Sequenz, um den Effekt des Schaltungsausfalls zu erreichen. Der transkriptionelle regulatorische Mechanismus von Quallen als mehrzellige Eukaryoten ist viel komplizierter und erfordert, dass der Promotor mit einer Vielzahl von kurz- und ferngestützten Verbesserungen und regulatorischen Sequenzen interagieren (Abbildung 22). Wenn die 5'-End-regulatorischen Sequenzen von Quallen in das Plasmid von E. coli getragen werden, können sie den Promotor-Kontext der Bakterien stören, wodurch die normale Expression des Zielgens beeinträchtigt wird. Wenn Prisher 1991 die PCR -Technologie nutzen könnte, wenn Mitarbeiter Mitarbeiter finden, würde die Geschichte der GFP -Forschung umgeschrieben. Das chinesische Lehrbuch der Mittelschule enthielt einst die berühmte Kurzgeschichte von Mr. Ye Shensingtao "A Drei oder fünf Puppen More", und wir können die tragische Art von Prallen zusammenfassen, wie er am Nobelpreis durch den Nachahmungs-Titel vorbeiging: 25 Basispaare wurden mehrfach geklont.

Abbildung 22: Der potenzielle molekulare biologische Mechanismus von 25 Basenpaaren des vorgebundenen Klons stört die GFP -Expression in E. coli.

Qian Yongjian sprach sofort wieder mit Prishe, nachdem er in Heim angekommen war. Prishe sandte den GFP -Genklon wie versprochen und teilte mit, dass das Charfi -Labor den Klon vor einem Monat erhalten habe. Qian Yongjian beschloss, einen gesunden Wettbewerb mit Charfi zu beginnen, als er bereits zu Beginn zurück war. Die beiden Seiten teilten Informationen mit und vermieden aktiv die Forschungsrichtung der anderen Partei. Da er wusste, dass Chalfie bewiesen hat, dass GFP in anderen Organismen alleine leuchten könnte, machte er Professor Qian hoffnungsvoll für seine Anwendungsaussichten mit seiner tiefen Grundlage in der organischen Chemie, und kann immer noch nicht verstehen, wie die drei Aminosäure-Ketten von Ser65-TYR66-Gly67 spontan zykliziert werden, um zu verkleben, und das, was zu einer Verknüpfung von Chromophore ist E Katalyse (Abbildung 23). Professor Qian kann sich nur zwei chemische Wege vorstellen: (1) Zwei Wasserstoffatome bilden sich zu Wasserstoff und werden freigesetzt, was in einer biochemischen Umgebung äußerst unwahrscheinlich ist; (2) Ein Oxidationsmittel wird benötigt, um die beiden Wasserstoffatome wegzunehmen, und das Oxidationsmittel, den der Experimentator direkt kontrollieren kann, ist nur Sauerstoff in der Luft. Professor Qian schlug vor, dass Heim E. coli, das GFP-Expressionsplasmide in einem streng absoluten sauerstofffreien Schüttler konstanter Temperatur enthält. Sie waren überrascht, dass GFP -Proteine ​​mit normalem Molekulargewicht zu diesem Zeitpunkt auf dem elektrophoretischen Gel beobachtet werden konnten, diese Bakterien jedoch nicht fluoreszieren konnten. Wenn das Bakterienkulturmedium zwei Stunden lang in die aerobe Umgebung zurückgeführt wird, ist eine grüne Fluoreszenz wieder zu sehen. Basierend darauf gab Professor Qian einen detaillierten chemischen Mechanismus für die spontane Bildung von Chromophoren durch GFP. Die theoretische Schlussfolgerung, dass Wasserstoffperoxid erzeugt wird, wird von anderen Labors erst 2006 bestätigt (Abbildung 23, oben rechts).

Abbildung 23 Quelle: Tsien, Ry (2008) Nobelvorlesung

Professor Qian ist auch verwirrt über die hohen und niedrigen Doppelpeaks des Wildtyp-GFP-Anregungsspektrums. Ultraviolette Strahlen können die GFP -Fluoreszenz effektiver stimulieren als blaues Licht (Abbildung 23, unten links). Basierend auf seiner organischen chemischen Intuition schlug er zu, dass die Seitenkette von Serin 65 (Ser65, S65) der Schlüssel zum Bimodal sein könnte. Während der Diskussion erinnerte Heim, ein Meister der molekularen Biologie, Professor Qian daran, dass er die ortsgesteuerte Mutagenese verwenden könnte, um Serin 65 durch andere Aminosäuren zu ersetzen, um diese Hypothese zu verifizieren. Wenn Serin durch Threonin (S65T) ersetzt wird, verschwindet der ultraviolette Anregungspeak tatsächlich und die Fluoreszenzanregungseffizienz des blauen Lichts auf dieser GFP ist das 8-fache des Wildtyp-GFP (Abbildung 23, unten links und unten rechts)! Die ortsgesteuerte Mutagenese-Methode öffnete das Hochwassertor für das Labor von Qian Yongjian, um die GFP umfassend zu verbessern. Das Blue Fluoreszenzprotein (BFP), das Cyan -Fluoreszenzprotein (CFP), das gelbe fluoreszierende Protein (YFP), ... sie haben der "Farbpalette" der experimentellen Biologen nacheinander bunte Farben hinzugefügt (Abbildung 23, unten rechts).

Der Nobelpreis für Chemie von 2008 wurde schließlich von Shimomura Shuai, Chalfie und Qian Yongjian geteilt. Prishe, der seit vielen Jahren nicht mehr in der akademischen Welt ist, wurde vom Ausschuss aufgrund der Beschränkungen der Anzahl der Personen im Nobelpreis nicht bevorzugt. Noch traurig ist, dass das Wasser in der Nähe des Hafens am Freitag aufgrund der durch die Ölgewinnung verursachten kontinuierlichen Umweltverschmutzung vollständig verschwunden war.

Empfohlene Lektüre

[1] Pieribone, V. & Gruber, DF (2005) Aglow im Dunkeln: Die revolutionäre Wissenschaft der Biofluoreszenz, Belknap Harvard.

[2] Shimomura, O. et al. (2017) Luminous Pursuit: Quallen, GFP und der unvorhergesehene Weg zum Nobelpreis, weltweit wissenschaftlich.

【GFP Discovery History Lecture Video】】

Link 1: https://youtu.be/ozjjnnvdzyc

Link 2: https://www.bilibili.com/video/bv17k4y1u7vv

Dieser Artikel wird aus dem WeChat Public Account "Medicine Times" nachgedruckt. Der Autor überarbeitete es zweimal, als "Bi Pu" veröffentlicht wurde.

Quelle: Fanpu