Die Entwicklungsgeschichte der CRISPR/Cas9-Technologie: Sie löste eine genetische Revolution aus, sobald sie auftauchte

Einführung

In der letzten Ausgabe haben wir hauptsächlich über Vererbung und Gene gesprochen. In dieser Ausgabe sprechen wir hauptsächlich über die Technologie der Genomeditierung, einschließlich ihrer Entwicklungsgeschichte, Klassifizierung, Prinzipien und Themen, die jeden betreffen, wie etwa die Anwendung der Technologie der Genomeditierung.

In dieser Ausgabe haben wir Herrn Chao Yanjie, einen Forscher am Shanghai Pasteur Institute, eingeladen. Während seines Doktoratsstudiums nahm Professor Chao an grundlegenden Experimenten teil, die zu den mit dem Nobelpreis ausgezeichneten Ergebnissen führten. Er hat mehr als 20 einflussreiche Artikel veröffentlicht, die mehr als 6.000 Mal zitiert wurden. Er ist ein „akademischer Rising Star“ auf diesem Gebiet.

01 Entwicklungsgeschichte der Gen-Editing -Technologie

Ye Shuisong: Gene bestimmen unsere Eigenschaften . Viele Wissenschaftler haben darüber nachgedacht, wie wir ein Problem mit den Genen beheben können . Professor Chao, können Sie uns etwas über die Entwicklungsgeschichte der Gen-Editing-Technologie erzählen?

Chao Yanjie : Die Technologie der Genom-Editierung hat tatsächlich eine lange Geschichte. Vor der Einführung von CRISPR/Cas9 wurde bereits viel wissenschaftliche Forschung im Labor durchgeführt.

Zuvor gab es zahlreiche Versuche und Werkzeugentwicklungen, insbesondere bei niederen Organismen wie E. coli oder Hefe, aber die Effizienz ist nicht hoch und erreicht bei weitem nicht das Anwendungsniveau im menschlichen Körper.

Bei der ersten Generation handelte es sich um größere Zinkfingernukleasen, die sehr ineffizient waren. Die zweite Generation ist die Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease.

Vor der Einführung von CRISPR war die nützlichste und effizienteste Generation von Werkzeugen zur Genombearbeitung das Genbearbeitungswerkzeug „Zinkfingerprotein“, das Proteine ​​zur DNA-Erkennung oder Genombearbeitung verwendet. Obwohl die Genauigkeit hoch ist, ist die Effizienz immer noch gering. Erst mit der Erfindung von CRISPR/Cas9 vor fast 10 Jahren wurde die neueste Generation der Genom-Editierungstechnologie verfügbar.

Durch die Entdeckung von CRISPR/Cas9 konnte die Effizienz der Technologie zur Genomeditierung auf ein sehr hohes Niveau gesteigert werden, das nun tatsächlich in der Humanforschung, der Säugetierforschung und sogar in der klinischen Forschung und Behandlung Anwendung finden kann.

Bisher hatte die Technologie der Genomeditierung eine relativ lange Geschichte und Grundlage. Erst in den letzten Jahren wurden mit der Entdeckung von CRISPR/Cas9 neue Durchbrüche erzielt, die es zu einer „Star-Technologie“ machten.

02 CRISPR/Cas9-Technologieprinzip

Ye Shuisong: Nachdem die CRISPR/Cas9-Technologie im Jahr 2012 auf den Markt kam, machten sich viele Menschen Sorgen darüber, „warum diese Technologie so große Auswirkungen haben würde“. Können Sie die Prinzipien dieser Technologie vorstellen?

Chao Yanjie: Das Aufkommen der CRISPR/Cas9-Technologie kann tatsächlich auf einen 2012 in Science veröffentlichten Artikel von Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier zurückgeführt werden.

Emmanuelle Charpentier

Jennifer Doudna

Die beiden Wissenschaftlerinnen zeigten, dass die Genomeditierung in vitro oder in E. coli durchgeführt werden kann, und stellten der wissenschaftlichen Gemeinschaft damit eine völlig neue Technologie zur Verfügung, die in der Folgezeit große Aufmerksamkeit erregte.

Später veröffentlichten die Wissenschaftler Zhang Feng und George Church jedoch zwei Artikel in Science, in denen sie erstmals die CRISPR/Cas9-Technologie nutzten, um eine groß angelegte Genomeditierung in menschlichen Zellen oder Säugetierzellen durchzuführen. Dies ist tatsächlich eine echte Anwendung der Technologie und hat daher mehr Aufmerksamkeit erregt.

Der chinesische Gelehrte Zhang Feng

Die Technologie hatte eine solche Wirkung, weil sie eine effiziente und groß angelegte Genombearbeitung in menschlichen Zellen in einem sehr kurzen Zeitraum (einige Monate oder weniger als ein Jahr) ermöglicht. Dadurch wurde den Menschen das enorme Potenzial und der Wert der Anwendung der Gen-Editierungstechnologie bewusst.

Das Prinzip dieser Technologie ist die Verwendung einer neuen Art von Nuklease, dem Cas9-Protein.

Diese Nuklease hat die Eigenschaft, dass sie nicht nach Belieben schneiden kann, sondern auf eine Nukleinsäure als Orientierungshilfe angewiesen ist. Dieser Leitfaden ist CRISPR oder Leit-RNA. Wenn diese RNA und das Protein einen Komplex bilden, kann das Protein so gesteuert werden, dass es genau an einer bestimmten Stelle schneidet.

Nur auf diese Weise kann die Genomeditierung eine hohe Effizienz und Genauigkeit erreichen und so potenzielle klinische therapeutische Anwendungen ermöglichen. Man kann daher sagen, dass Doudna und Charpentier auf diesem Gebiet Pionierarbeit geleistet haben.

03 Vorteile der CRISPR/Cas9-Technologie

Ye Shuisong : Was sind die Vorteile der CRISPR/Cas9-Technologie im Vergleich zu anderen Technologien zur Genombearbeitung und was sind ihre Nachteile?

Chao Yanjie: CRISPR/Cas9 hat viele Vorteile. Damit lässt sich die Situation der „Vereinigung der Welt“ in kürzester Zeit erreichen, vor allem weil es einfach, durchführbar und effizient ist. Der CRISPR/Cas9-Leitfaden verwendet ein Stück Nukleinsäure oder RNA, das unendliche Möglichkeiten bietet und in vitro mit sehr hoher Effizienz und geringen Kosten synthetisiert werden kann.

Es kann innerhalb weniger Tage Tausende von Leitfäden synthetisieren und unzählige Stellen, jedes menschliche Gen und die Gene jeder Art bearbeiten. Die Effizienz dieser Technologie wird von keiner anderen Methode erreicht.

Gleichzeitig sind der Zeit- und Kostenaufwand von CRISPR/Cas9 sehr gering. Leit-RNA kann in nur wenigen Tagen synthetisiert und die Bearbeitung in Säugetierzellen abgeschlossen werden. Die Bearbeitungseffizienz ist ebenfalls sehr hoch und ein grobes Screening kann in kurzer Zeit durchgeführt werden, um bearbeitete Zellen und Produkte zu erhalten.

Ein weiterer Vorteil ist, dass CRISPR/Cas9 viele Gene gleichzeitig bearbeiten kann. Da Leit-RNAs unendlich kombinierbar sind, können mehrere Leit-RNAs verwendet werden, um mehrere Gene in einer Zelle gleichzeitig anzusprechen. Dieser Vorteil ist bei anderen Methoden unerreicht.

Wo es Vorteile gibt, gibt es natürlich auch Nachteile. In der klinischen Praxis besteht der Nachteil von CRISPR/Cas9 darin, dass die Bearbeitung bestimmte Off-Target-Effekte hat und die gewünschte Bearbeitung nicht an 100 % der Stellen abgeschlossen wird. Dies ist ein Problem, das bei allen Bearbeitungstechnologien besteht.

Trotz dieser Mängel versuchen technische Entwickler derzeit, diese Technologie zu verbessern, und viele Wissenschaftler optimieren und entwickeln diese Technologie ständig weiter.

04 Der Erfinder von CRISPR/Cas9

Ye Shuisong : Wir wissen, dass Sie damals auch mit der Nobelpreisträgerin Emmanuelle Charpentier zusammengearbeitet haben und Ihr Name sogar auf mehreren ihrer bahnbrechenden Arbeiten stand. Können Sie uns die Geschichten einiger Pioniere dieser Technologie erzählen? Woran arbeitete Charpentier, bevor er den Artikel in Science veröffentlichte , und erhielt er so viel Aufmerksamkeit wie heute?

Chao Yanjie: Ich kenne die Nobelpreisträgerin Emmanuelle Charpentier recht gut. Wir gehören demselben kleineren Fachgebiet an, der „Biologie der prokaryotischen RNA“, und sie begann bereits mit unserem Labor zusammenzuarbeiten, bevor sie Erfolg hatte.

Tatsächlich war ich Mitautor des Artikels, in dem CRISPR/Cas9 erstmals entdeckt wurde.

Unter ihnen ist der Forscher Chao Yanjie

Bevor sie mit diesem Artikel Berühmtheit erlangte, war sie eine Forschungsgruppenleiterin auf niedriger Ebene, die es schwer hatte, ihre Forschungsgruppe in Wien zu leiten.

Zu ihren damaligen Interessengebieten zählten unter den pathogenen Bakterien auch Streptokokken. Sie hoffte, einige neue Arten nicht-kodierender kleiner RNA in Streptococcus zu entdecken.

Später begann sie mit unserem Labor zusammenzuarbeiten, das über RS-Sequenzierungstechnologie (Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung) und Forschungsgrundlagen im Bereich nichtkodierender kleiner RNA verfügt. Dann entdeckten wir kleine nicht-kodierende RNAs in ihrer pathogenen Bakterienart.

Damals war diese Grundlagenforschung rein interessengeleitet. Wir hätten nie gedacht, dass diese Arbeit in Nature veröffentlicht werden könnte oder dass sie zu einer bedeutenden, weltverändernden Forschung wie CRISPR/Cas9 führen könnte.

Damals experimentierten wir so viel wie möglich für diese Aufgabe und entdeckten einen neuen Typ kleiner nichtkodierender RNA in Streptococcus. Zufällig ist diese kleine RNA mit CRISPR verwandt und interagiert mit CRISPR/Cas9.

Aufgrund dieser Tätigkeit verlief auch Charpentiers akademische Entwicklung reibungslos. Sie verließ die Universität Wien und ging nach Schweden, um dort ein neues Labor aufzubauen. Später kehrte sie nach Deutschland zurück, um dort ein größeres Labor aufzubauen. Während dieses Prozesses haben wir alle kommuniziert.

Charpentier leistet weiterhin herausragende Arbeit auf dem Gebiet der RNA-Biologie pathogener Bakterien und hat am Max-Planck-Institut in Berlin eine neue Forschungseinheit gegründet.

05 Wichtige Beiträge chinesischer Wissenschaftler

Ye Shuisong : Daher ist es oft schwierig, eine originelle, innovative Technologie zu entwickeln, bevor sie entsteht. Interesse ist der beste Lehrer. Wir wissen, dass chinesische Wissenschaftler auf diesem Gebiet sehr wichtige Beiträge geleistet haben. Beispielsweise hat Zhang Feng wichtige Auszeichnungen wie den Gairdner Award gewonnen. Können Sie seine und die wichtigsten Beiträge mehrerer anderer chinesischer Wissenschaftler auf diesem Gebiet vorstellen?

Chao Yanjie: Tatsächlich haben unsere chinesischen Wissenschaftler auf diesem Gebiet sehr große Beiträge geleistet, insbesondere zur Entwicklung und zum Wachstum der heimischen Biowissenschaften. Auf diesem Gebiet spiegeln sich unsere chinesischen Beiträge wider.

Einer der Vertreter ist Zhang Feng, der sich auf dem Gebiet der Genomeditierung engagiert. Bevor CRISPR/Cas9 entdeckt wurde, hatte er bereits in den USA an der Genomeditierung gearbeitet, wahrscheinlich im Church-Labor. Er verwendet Zinkfingerproteine ​​zur Genomeditierung.

Als CRISPR/Cas9 auftauchte, hörte er schon während des Schreibens des Artikels von diesem Werkzeug und war sehr interessiert und schockiert, da er glaubte, dass darin die Zukunft liege. Daher ist er möglicherweise einer der ersten Wissenschaftler weltweit, der sich mit der CRISPR-Forschung beschäftigt.

Und deshalb hatten Doudna und Charpentier, als sie 2012 ihren Artikel in Science veröffentlichten, diese Werkzeuge bereits innerhalb eines Jahres zur Genomeditierung in Säugetierzellen eingesetzt.

Daher kann man sagen, dass Zhang Feng ein Pionierwissenschaftler in der Anwendung von CRISPR/Cas9 ist. Danach hatte er nicht nur diese eine Arbeit oder diese eine Anwendung, die den ersten Platz gewann, sondern eine Reihe von Arbeiten, die sich auf diesem Gebiet etablierten und viele neue Beiträge lieferten. Beispielsweise nutzten Charpentier und Doudna das Protein CRISPR/Cas9 zur Genomeditierung. Zhang Feng glaubt jedoch, dass es viele Proteine ​​dieser Art geben müsste. In der Natur herrscht eine große Artenvielfalt und möglicherweise gibt es andere Proteine, die besser, effizienter und für die Anwendung wertvoller sind.

Anschließend arbeitete er mit einer Person zusammen, die sich am NCBI in den USA mit der bioinformatischen Genforschung beschäftigte, und entdeckte viele funktionsspezifische Cas-Proteine ​​in verschiedenen schwer zu kultivierenden Mikroorganismen. Mithilfe dieser Cas-Proteine ​​wurden dann weitere oder ausgefeiltere Techniken zur Genombearbeitung entdeckt. Er entdeckte, dass Gen-Editierung nicht nur möglich ist, sondern auch für genetische Diagnosen und Tests eingesetzt werden kann.

06 Hervorragende Arbeit im Bereich der Genomeditierung in China

Ye Shuisong : Lehrer Chao, können Sie kurz über einige der Höhepunkte der Arbeit auf diesem Gebiet in China sprechen?

Chao Yanjie: Es gibt in China tatsächlich viele herausragende Wissenschaftler. Unser Land nutzt CRISPR/Cas9 zur Transformation von Tieren und Pflanzen in der Landwirtschaft und mehrere landwirtschaftliche Hochschulen haben in der Tierzucht relativ gute Ergebnisse erzielt. Auch bei Affen wurde eine Genomeditierung durchgeführt, die zahlreiche Modelle für die klinische Forschung oder Krankheitsforschung liefert.

Darüber hinaus sind einige Wissenschaftler der Peking-Universität in der Lage, CRISPR zur Behandlung von Krankheiten einzusetzen, beispielsweise bei der Behandlung von HIV oder Infektionskrankheiten, und haben ebenfalls sehr gute Beiträge geleistet.

07 Optimierung der Genomeditierungstechnologie

Ye Shuisong : Derzeit gibt es einige Möglichkeiten für Off-Target-Effekte der CRISPR/Cas9-Genbearbeitung beim Menschen sowie einige Probleme wie die AAV-Vektorübertragung und Immunogenität . Wenn diese Technologie in Zukunft klinisch eingesetzt werden soll, welche Aspekte müssen Ihrer Meinung nach optimiert werden?

Chao Yanjie: Ich denke, das Liefersystem ist ein Bereich, der optimiert werden muss, da CRISPR/Cas9 immer noch eine Substanz bakteriellen Ursprungs oder eine für den menschlichen Körper exogene Substanz ist. Die Übertragung von CRISPR/Cas9 auf menschliche Zellen und die Durchführung einer idealen Bearbeitung in idealen Gewebezellen erfordert einige Prozesse.

Aktuelle Anwendungen beschränken sich auf die lokale Bearbeitung, insbesondere bei Netzhaut- und Sehnerverkrankungen. Dabei handelt es sich um eine Bearbeitungsmethode, die durch lokale Injektion in die Zellen des Auges erfolgt. Dies lässt sich nicht auf alle Krankheitsarten übertragen. Bei Blutkrankheiten beispielsweise können Blutzellen nur entnommen, in vitro bearbeitet und dann wieder in den Körper infundiert werden.

Um CRISPR/Cas9 tatsächlich die beliebige Bearbeitung idealer Organe und Zellen zu ermöglichen, sind daher noch entsprechende Forschungsarbeiten zur Transportmethode erforderlich, um ein gezieltes Eindringen in ideale Zielzellen zu ermöglichen.

Ein weiteres ist ein Off-Target-Gen. Diese Forschung ist die Richtung, in die alle Wissenschaftler der Welt arbeiten. Wenn bei der Behandlung von Menschen oder der Genbearbeitung ein unerwünschtes Phänomen auftritt, wird es in das menschliche Genom integriert, an die nächste und übernächste Generation vererbt und bleibt dauerhaft in der genetischen Geschichte des Menschen bestehen. Daher wird die Möglichkeit eines Zielverstoßes weitreichende Folgen haben.

Nun hoffen alle Wissenschaftler weltweit, die auf diesem Gebiet arbeiten, die Effizienz und Genauigkeit der Genomeditierung weiter zu optimieren.

08 Wie wird sich die Genomeditierung in Zukunft entwickeln?

Ye Shuisong : Wohin wird sich die Gentherapie Ihrer Meinung nach in Zukunft entwickeln?

Chao Yanjie: Menschen, die sich mit Biologie beschäftigen, werden die Vielfalt der Natur schätzen oder verstehen. Das Aufkommen dieser verschiedenen Werkzeuge ist eigentlich eine Entwicklung der Biotechnologie. Jedes Werkzeug hat sein ideales oder am besten geeignetes Anwendungsszenario.

Ich glaube nicht, dass die Gentherapie in Zukunft durch andere Behandlungsmethoden ersetzt wird. Stattdessen sollten wir darüber nachdenken, welche Krankheiten und welche spezifischen Szenarien mit einer Gentherapie behandelt werden müssen. Was mir dabei einfällt, ist die Erforschung einiger seltener Krankheiten oder genetischer Erkrankungen, da diese Krankheiten durch DNA-Defekte oder Genom-Defekte verursacht werden. Daher kann eine Bearbeitung auf DNA-Ebene das Problem mit nur einer Bearbeitung vollständig lösen. Dies kann durch eine Gentherapie nicht ersetzt werden und stellt das geeignetste Behandlungsszenario dar.

Darüber hinaus handelt es sich bei mRNA-Impfstoffen und Proteinabbauexperimenten noch immer um eine sich entwickelnde Technologie. Obwohl es im COVID-19-Prozess als Präzedenzfall für Impfstoffe verwendet wurde, ist es noch nicht ausgereift genug, insbesondere bei der Behandlung genetisch bedingter Erkrankungen.

Für welche Szenarien sie sich am besten eignen oder welche Probleme sie lösen, muss noch weiter erforscht werden.

Dieser Artikel wird vom Science Popularization China Starry Sky Project Team/Autor unterstützt: Deep Study Science Review: Tao Ning, Associate Researcher, Institut für Biophysik, Chinesische Akademie der Wissenschaften

Produziert von: Chinesische Vereinigung für Wissenschaft und Technologie, Abteilung für Wissenschaftspopularisierung. Produziert von: China Science and Technology Press Co., Ltd., Beijing Zhongke Xinghe Culture Media Co., Ltd.